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mardi 25 avril 2017

Imagerie multi-échelles

 

Neso Sojic, Stéphane Arbault, Dodzi Zigah, Valérie Ravaine, Alexander Kuhn, Laurent Bouffier, Bertrand Goudeau, Patrick Garrigue

Dans cette thématique, nous nous intéressons à la mise au point de nouveaux outils et méthodes dans le domaine de la chimie bioanalytique et de l'imagerie à l'échelle nanométrique combinant optique, luminescence et électrochimie. Les principaux sujets de nos études sont les suivants :

1. Dispositifs optiques pour l'imagerie
2. Imagerie par Electrochimiluminescence
3. Imagerie électrochimique

1. Dispositifs optiques pour l'imagerie

Par des procédés d'attaque chimique contrôlée de faisceaux de fibres optiques en milieu humide, notre équipe a développé un savoir-faire pour la mise au point de réseaux denses de nanopointes utilisables pour la détection d'ADN ou l'imagerie à échelle nanométrique par Spectroscopie Raman à Exaltation de Surface (SERS). Les structures ainsi obtenues conservent l'architecture initiale du faisceau de fibres ainsi que leurs propriétés optiques intrinsèques. L'utilisation de ce faisceau pour effectuer de l'imagerie par SERS à distance a pu être mise en évidence de manière satisfaisante grâce à une collaboration en interne avec le groupe Spectroscopie Moléculaire de l'ISM. Une technique d'imagerie à distance a également été développée dans le cadre d'une collaboration industrielle avec le groupe L'Oréal afin d'observer les cornéocytes présents à la surface de la peau humaine.

micro-1 a) Principe de mesure SERS avec un réseau de nanopointes ; b) Image prise à distance de cornéocytes présents sur la peau de l'avant-bras d'un témoin ; c) Image de fluorescence de plots d'ADN electropolymérisés sur les pointes d'un réseau.

La compréhension des processus métaboliques à l'échelle d'un organite unique, notamment une mitochondrie, est d'un intérêt majeur pour différents domaines biomédicaux. En effet, des hétérogénéités génétiques et métaboliques existent au sein du réseau mitochondrial de chacune de nos cellules et il est donc nécessaire de pouvoir observer des objets individuellement.
Afin de résoudre cette problématique, nous avons élaboré des réseaux de micro-puits capables de mesurer la fluorescence émise par des mitochondries isolées. Actuellement, nous cherchons à développer un procédé de suivi multiparamètres de l'activité métabolique des mitochondries en utilisant des colorants ou des métabolites endogènes fluorescents.
Notre objectif est axé sur la compréhension des relations cinétiques entre les fluctuations potentielles des membranes mitochondriales et la formation des dérivés réactifs de l'oxygène et de l’azote. Nous combinons aussi ces approches s'appuyant sur la microscopie de fluorescence avec des capteurs électrochimiques miniaturisés (cf. Electrochimie des Biosystèmes).

micro-2Visualisation des variations de fluorescence de NADH dans les mitochondries individuelles (Saccharomyces cerevisiae) à différentes phases : Phase 1, mitochondries au repos ; Phase 2, mitochondries alimentés par injection d'éthanol à 1% dans le puits ; Phase 3, inhibition de la respiration mitochondriale par injection d’antimycine A, un inhibiteur classique du complexe III dans la chaîne respiratoire.

 

2. Imagerie par Electrochimiluminescence

L’Electrochimiluminescence (ECL) correspond au rayonnement émis par un luminophore résultant d'une réaction initiale de transfert électronique se produisant à la surface de l'électrode. En d'autres termes, ce phénomène résulte d’une combinaison entre électrochimie et photochimie. Son usage est d’ores et déjà très répandu puisque des dosages immunologiques basés sur l'ECL sont largement commercialisées. Notre groupe a développé une méthode de photogravure pour l'immobilisation de films ECL ultra-minces. Des films d'hydrogel ECL ont été immobilisées sous forme de motifs photogravés uniformes dont la taille, la forme et l’épaisseur peuvent être modulées par choix des paramètres de fabrication. La conception et la mise en œuvre d'une nouvelle classe de puces de détection ont également retenu notre attention. L’ECL a alors été utilisé en tant que mécanisme de lecture pour détecter simultanément de multiples antigènes. Ce procédé permet notamment des mesure en multiplexage puisque les billes du réseau codant chacune pour un antigène particulier sont imagées simultanément par ECL.

micro-3a) Images ECL de différents motifs de films nanométriques minces obtenus sur une électrode d'or. b) Support pour dosages immunologiques par multiplexage : la détection d’antigènes est assurée par un microréseau de billes ECL-actives.


Les particules d'hydrogel, ou « microgels », apparaissent comme des nanomatériaux stimuli-sensibles particulièrement intéressants. Leurs propriétés peuvent être modulées par un stimulus externe qui provoque l'expansion ou la contraction du réseau de polymère et leur confère des capacités de détection (cf. Capteurs Chimiques et Biochimiques). Grâce à un choix de systèmes ECL et microgels modèles, nous avons pu étudier l'électrochimieluminescence de microgels sensibles à la chaleur. Il a alors été possible de constater l’amplification du signal ECL au moment de la rétractation des particules de microgel.

Les nanotubes de carbone (NTC) se sont récemment révélé être des outils analytiques de choix possédant une large gamme de propriétés électroniques et mécaniques. Par exemple, dans le cas de biocapteurs électrochimiques, les NTC sont utilisés pour structurer des électrodes et accroître la surface électroactive correspondante. Nous développons une approche originale basée sur des tubes qui sont modifiés de manière sélective (sur une seule extrémité) par électrochimie bipolaire afin de générer des systèmes asymétriques pour l’analyse disposant d’un seuil de détection amélioré. Cette approche originale combine en réalité électrochimie bipolaire et réduction de sels de diazonium. L'électroréduction des sels de diazionium permet l'immobilisation d’une couche organique attachée par liaison covalente. Cette phase organique peut être alors utilisée pour développer le système analytique requis.

micro-4  a) Représentation schématique des microgels ECL thermo-sensibles dans leur état gonflé (à gauche) et contracté (à droite) ; b) Image TEM de microgels secs ; c) Nageur asymétrique émettant de la lumière. La réduction synergique de l’eau au pôle cathodique et l'oxydation des réactifs ECL au niveau du pôle anodique induit simultanément le mouvement et l'émission de lumière de la bille dans un tube capillaire.


L’électrochimie bipolaire, généralement employée dans notre groupe pour modifier les objets de manière asymétrique (cf. Particules Intelligentes) peut également être appliquée à la production simultanée de bulles de gaz d’un signal ECL sur les deux pôles d'une bille conductrice. Elle nous a conduit a décrire, pour la première fois, le mécanisme de propulsion d’un nageur couplé avec l’émission d’une lumière chimique. Dans ce cas, l’ECL permet un contrôle direct du mouvement, pouvant être très utile pour localiser les micromoteurs par exemple. Des modifications chimiques de la surface de l'objet en mouvement permet alors la modulation de la couleur émise en utilisant, par exemple, la réaction classique entre le luminol et le péroxyde d’hydrogène pour conduire à la création d’un nageur émettant de la lumière bleue.

3. Imagerie Electrochimique


La microscopie à balaye électrochique (SECM) a été décrite pour la première au début des années 90 et est aujourd'hui largement utilisée pour étudier les phénomènes d'interface. Par balayage d'une ultra-microélectrode (UME) au-dessus d'une surface, une image en trois dimensions peut être obtenue. La SECM peut être utilisée afin d'obtenir une image topographique et/ou chimique. Il est ainsi possible d'observer l'emplacement des sites enzymatiques sur une membrane ou d'identifier les différentes zones de réactivité d’une surface. Par exemple, nous avons pu étudier une couche de polypyrrole déposée sur une électrode d’or par électrochimie bipolaire. Grâce à la SECM nous avons pu prouver que cette couche présente diverses réactivités en fonction du potentiel de dépôt appliqué.

micro-5

a) Ultramicroélectrode et sa couche de diffusion à proximité du substrat ; b) Substrat : polypyrrole sur or ; c) Image SECM, l’intensité de courant la plus élevée (en rouge) correspondant à la couche d’or.

Références

Remote Surface Enhanced Raman Spectroscopy Imaging via a Nanostructured Optical Fiber Bundle
Optics Express 200917, 24030-24035.

Multiplexed Sandwich Immunoassays using Electrochemiluminescence Imaging Resolved at the Single Bead Level
J. Am. Chem. Soc. 2009131, 6088-6089.

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